摘要

新生小鼠視網(wǎng)膜活體電轉(zhuǎn)化技術(shù)為視網(wǎng)膜發(fā)育及疾病研究提供關(guān)鍵手段。研究借助威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀，優(yōu)化電轉(zhuǎn)化參數(shù)，實(shí)現(xiàn)外源基因在新生小鼠視網(wǎng)膜的高效遞送與表達(dá)，顯著提升轉(zhuǎn)染效率，為視網(wǎng)膜相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供可靠技術(shù)平臺。

引言

視網(wǎng)膜作為視覺信號傳遞的關(guān)鍵組織，其發(fā)育機(jī)制及疾病發(fā)生機(jī)理的研究一直是眼科領(lǐng)域的熱點(diǎn)。新生小鼠視網(wǎng)膜處于快速發(fā)育階段，此時(shí)進(jìn)行基因操作可有效研究基因在視網(wǎng)膜細(xì)胞分化、遷移及功能建立中的作用。然而，傳統(tǒng)的基因遞送方法在活體視網(wǎng)膜操作中存在效率低、細(xì)胞損傷大等問題，難以滿足精準(zhǔn)科研需求。

電轉(zhuǎn)化技術(shù)通過脈沖電場瞬時(shí)改變細(xì)胞膜通透性，使外源核酸等大分子進(jìn)入細(xì)胞，在活體組織基因遞送中展現(xiàn)出優(yōu)勢。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀憑借其先進(jìn)的方波脈沖技術(shù)、智能監(jiān)控系統(tǒng)及靈活的參數(shù)設(shè)置，為新生小鼠視網(wǎng)膜活體電轉(zhuǎn)化提供了高效精準(zhǔn)的解決方案，助力科研人員突破傳統(tǒng)技術(shù)瓶頸。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)動物

出生后 0-2 天（P0-P2）的 C57BL/6J 新生小鼠，由本實(shí)驗(yàn)室 SPF 級動物房提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度 50%-60%，12 小時(shí)光照 / 黑暗循環(huán)。

2. 主要試劑

質(zhì)粒 DNA（含目的基因 GFP，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）、某試劑（用于配制電轉(zhuǎn)緩沖液，含 NaCl、KCl、葡萄糖等成分，pH 值調(diào)至 7.4）、麻醉劑（異氟烷，用于小鼠麻醉）、消毒試劑（75% 乙醇）。

3. 主要儀器

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀、體視顯微鏡（某品牌，用于手術(shù)操作觀察）、顯微注射針（外徑 10-15μm，用于質(zhì)粒注射）、恒溫加熱板（維持小鼠體溫）。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 小鼠麻醉與固定

將新生小鼠置于含異氟烷的麻醉盒中，誘導(dǎo)麻醉后轉(zhuǎn)移至恒溫加熱板上，保持體溫穩(wěn)定。使用膠帶輕輕固定小鼠頭部及四肢，確保手術(shù)過程中小鼠體位穩(wěn)定。

2. 視網(wǎng)膜定位與質(zhì)粒注射

在體視顯微鏡下，用微量上樣針吸取含目的基因的質(zhì)粒 DNA（濃度為 1-2μg/μL），從小鼠眼球顳側(cè)角膜緣處進(jìn)針，緩慢將針尖插入玻璃體腔，避開晶狀體，準(zhǔn)確將 5-10μL 質(zhì)粒溶液注射到視網(wǎng)膜下腔。注射過程中注意控制進(jìn)針深度和速度，避免損傷視網(wǎng)膜組織。

3. 電穿孔參數(shù)設(shè)置與操作

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀采用預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)，針對新生小鼠視網(wǎng)膜組織特點(diǎn)，選擇哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染模式，調(diào)用內(nèi)置的視網(wǎng)膜細(xì)胞推薦參數(shù)：方波脈沖，電壓根據(jù)小鼠年齡及眼球大小調(diào)整（一般為 50-80V），脈沖時(shí)長 10-20ms，脈沖次數(shù) 3-5 次，脈沖間隔 1-2s。

將定制的鑷子型電極（電極間距 1-2mm，表面經(jīng)絕緣處理，避免電流泄漏）輕輕夾住小鼠眼球，確保電極與眼球表面緊密貼合，且不壓迫眼球。通過腳踏開關(guān)啟動電穿孔程序，儀器 10 英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示脈沖波形與參數(shù)動態(tài)，便于實(shí)驗(yàn)者監(jiān)控整個(gè)過程。電穿孔過程中，儀器自動進(jìn)行智能阻抗檢測，預(yù)脈沖測量樣品電阻，動態(tài)調(diào)整參數(shù)，確保每次電擊條件與視網(wǎng)膜細(xì)胞狀態(tài)匹配。同時(shí)，電弧防護(hù)與極性轉(zhuǎn)換技術(shù)杜絕了電弧損傷，突破細(xì)胞膜電荷屏障，提升難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的成功率。

4. 術(shù)后處理

電轉(zhuǎn)操作完成后，將小鼠移回母鼠身邊，保持環(huán)境溫暖安靜。術(shù)后每天觀察小鼠眼部狀態(tài)及存活情況，確保無感染及其他并發(fā)癥發(fā)生。

結(jié)果與討論

轉(zhuǎn)染效率檢測

在電轉(zhuǎn)后 3 天，取小鼠眼球，制備視網(wǎng)膜冰凍切片，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞均可見明顯的 GFP 熒光信號，尤其是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層，轉(zhuǎn)染效率較傳統(tǒng)方法提升超 40%（基于威尼德內(nèi)部測試數(shù)據(jù)）。這得益于威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的高強(qiáng)度電場瞬時(shí)重塑細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)了核酸大分子的高效遞送。

細(xì)胞存活與組織損傷評估

通過蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，電轉(zhuǎn)組小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，與對照組相比，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死或炎癥反應(yīng)。臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)顯示，電轉(zhuǎn)后視網(wǎng)膜細(xì)胞存活率達(dá) 90% 以上，表明該電轉(zhuǎn)化技術(shù)對視網(wǎng)膜組織損傷小，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可行性。

與傳統(tǒng)技術(shù)對比優(yōu)勢

傳統(tǒng)的病毒載體轉(zhuǎn)染方法存在制備周期長、成本高、載體容量有限等問題，且可能引發(fā)免疫反應(yīng)。而威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀介導(dǎo)的活體電轉(zhuǎn)化技術(shù)，無需病毒包裝，可直接遞送 DNA、RNA 及蛋白質(zhì)等大分子，操作簡便快捷，成本低，同時(shí)避免了病毒載體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。其全波形智能監(jiān)控系統(tǒng)確保實(shí)驗(yàn)過程透明可控，數(shù)據(jù)可追溯，助力科研結(jié)果的精準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)。預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置常用細(xì)胞株參數(shù)庫，一鍵調(diào)用，同時(shí)支持自定義脈沖參數(shù)，適配新生小鼠視網(wǎng)膜等復(fù)雜場景，展現(xiàn)出強(qiáng)大的靈活性和適用性。

技術(shù)優(yōu)化與注意事項(xiàng)

在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)電穿孔參數(shù)的優(yōu)化是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素。電壓過高或脈沖次數(shù)過多可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而電壓過低則轉(zhuǎn)染效率不足。威尼德 Gene Pulser 830 的智能阻抗檢測功能能夠根據(jù)樣品電阻動態(tài)調(diào)整參數(shù)，有效解決了這一問題。此外，注射質(zhì)粒的濃度和體積、電極的貼合程度以及小鼠的日齡均會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，需嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。

應(yīng)用前景

基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)基因的功能研究，如 CRISPR 基因編輯技術(shù)結(jié)合電轉(zhuǎn)化，可實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜特定基因的敲除或敲入，研究其在視網(wǎng)膜細(xì)胞分化、神經(jīng)環(huán)路形成中的作用；siRNA 遞送可用于抑制目標(biāo)基因表達(dá)，探索基因在視網(wǎng)膜疾病發(fā)生中的機(jī)制；干細(xì)胞重編程研究中，電轉(zhuǎn)化技術(shù)可將重編程因子高效導(dǎo)入視網(wǎng)膜干細(xì)胞，為視網(wǎng)膜再生醫(yī)學(xué)研究提供新途徑。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

在活體腫瘤電轉(zhuǎn)方面，可針對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等眼部腫瘤，通過電轉(zhuǎn)化遞送治療性基因或藥物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向治療；疫苗開發(fā)中，電轉(zhuǎn)化技術(shù)可將抗原基因遞送至視網(wǎng)膜相關(guān)免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，為眼部疫苗研究提供新思路；體內(nèi)基因治療方面，對于遺傳性視網(wǎng)膜疾病，如色素性視網(wǎng)膜炎、先天性黑蒙癥等，電轉(zhuǎn)化技術(shù)可將正?；?qū)胍暰W(wǎng)膜細(xì)胞，為基因治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

農(nóng)業(yè)與工業(yè)領(lǐng)域

雖然研究聚焦于新生小鼠視網(wǎng)膜，但威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的廣泛適用性使其在農(nóng)業(yè)與工業(yè)領(lǐng)域也具有巨大潛力。在植物遺傳改良中，可用于植物原生質(zhì)體的基因遞送，加速農(nóng)作物品種改良；酵母工程菌構(gòu)建及微生物代謝工程中，電轉(zhuǎn)化技術(shù)可高效實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)?，提高工程菌的生產(chǎn)效率。

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀憑借其革新的方波脈沖技術(shù)、智能監(jiān)控系統(tǒng)及深度的技術(shù)服務(wù)支持，已成為超 500 家頂尖科研機(jī)構(gòu)的信賴之選。無論是基礎(chǔ)研究中的精準(zhǔn)基因操作，還是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的創(chuàng)新治療探索，該設(shè)備都為科研人員提供了高效可靠的技術(shù)平臺。目前，威尼德提供免費(fèi)技術(shù)方案咨詢及產(chǎn)品試用服務(wù)，助力科研人員攻克轉(zhuǎn)染技術(shù)壁壘，推動生命科學(xué)研究及相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

1. 氧誘導(dǎo)新生小鼠視網(wǎng)膜病變中血管新生和氧應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的變化 [J] . 余增洋 ,龔陳媛 ,張國慶 . 中國藥理學(xué)通報(bào) . 2014,第010期

2. 單核細(xì)胞趨化蛋白-1在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達(dá) [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志 . 2012,第004期

3. 單核細(xì)胞趨化蛋白-1在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達(dá) [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志 . 2012,第004期

4. 新生小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)變化及意義 [J] . 董寧 ,褚利群 ,肖林 . 山東醫(yī)藥 . 2011,第026期

5. MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達(dá) [J] . 姜雙 ,陳曉隆 . 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2009,第006期